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    原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系

    發(fā)布時間： 2021-07-07　　點擊次數(shù)： 1434次
    原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系
    凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)。
    原代細(xì)胞的取材
    人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
    一、取材的基本要求
    .1．取材要注意新鮮和保鮮
    .2．應(yīng)嚴(yán)格無菌
    .3．防止機械損傷
    .4．去除無用組織和避免干燥
    .5．應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等
    .6．作好記錄
    二、各類組織的取材技術(shù)
    皮膚和粘膜的取材
    內(nèi)臟和實體瘤的取材
    血液細(xì)胞的取材
    骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材
    動物組織取材
    人胚體組織取材
    雞（鴨）鳥類胚胎組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材
    皮膚和粘膜的取材
    主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般 2~4 平方厘米。
    內(nèi)臟和實體瘤的取材
    內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締織。
    血液細(xì)胞的取材
    血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、
    淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝。
    骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材
    嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂 PBS 洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。
    動物組織取材
    1、鼠胚組織取材
    首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有 75%酒精的燒杯中，5 分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
    2、幼鼠胚腎（或肺）取材
    幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
    人胚體組織取材
    取材方法與鼠類相同
    雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟
    （1）取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12 天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
    （2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用 75%酒精棉球擦干；
    （3）經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；
    （4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；
    （5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。
    原代細(xì)胞的分離和制作
    人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁
    殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。
    一、懸浮細(xì)胞的分離方法
    組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，用簡單的方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
    二、實體組織材料的分離方法
    對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。
    （一）機械分散法
    方法:特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少
    的軟組織。
    （二）消化分離法
    組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
    1．酶消化分離法
    酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶
    胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開。
    影響胰蛋白酶作用的主要因素
    細(xì)胞類型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH .無機鹽離子.消化時間
    膠原酶（Collagenase）消化法
    膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。
    2．非酶消化法（EDTA 消化法）
    EDTA 是一種非酶消化物，又稱螯合劑或 Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。
    3．消化分離法的操作步驟
    剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散
    4．消化分離法的注意事項
    （1）組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。
    （2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
    （3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。
    三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法
    原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從供體取得組織細(xì)胞在體外進行的初次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細(xì)胞較為接近和最能反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細(xì)胞分化等實驗研究。
    （一）組織塊培養(yǎng)法
    組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長。
    （二）消化培養(yǎng)法
    （三）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法
    對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。
    （四）器官培養(yǎng)
    器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。
    原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持
    原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持
    原代細(xì)胞培養(yǎng)的初次傳代
    傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
    傳代細(xì)胞的建系和維持
    一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持
    (一)原代細(xì)胞培養(yǎng)：
    1．靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)
    2．懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)
    靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求
    細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；
    細(xì)胞接種時濃度要稍大一些，至少為 5×108 細(xì)胞/L；
    培養(yǎng)基可用 Eagle(MEM)或 DNEM 培養(yǎng)；
    小牛血清濃度為 10%-80%；
    應(yīng)在 37℃5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
    在起始的 2 天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂?。?/div>
    待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液；
    用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng) 1 周時，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后換液；
    懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細(xì)胞；
    短期培養(yǎng)，可在含 10%小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中進行；
    細(xì)胞濃度可在 5-8×109/L 范圍內(nèi)，.進行分瓶試驗；
    長期培養(yǎng)時，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)
    胞生長；
    細(xì)胞換液一般每隔 3 天需半量換液一次；
    細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時才能進行；
    (二)原代細(xì)胞的維持
    貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足
    細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要；
    換入等量*培養(yǎng)基或換成含 2%小牛血清的維持液；
    懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不
    能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，需進行換液。通常采用半量換液的方法；
    二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的初次傳代
    原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個瓶
    底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接
    種的過程稱之為傳代。
    初次傳代應(yīng)注意以下幾點：
    (1)細(xì)胞生長密度不高時，不能急于傳代。
    (2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時間。
    (3)吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。
    (4)初次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。
    (5)初次傳代培養(yǎng)的 pH 應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至 15%～20%左右
    三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
    傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進行細(xì)胞傳代。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進行傳代。
    貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟
    (1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以 25mL 培養(yǎng)瓶為例）。
    (2)每瓶加入 2mL，無鈣、鎂 PBS，漂洗一次后倒掉。
    (3)每瓶加入 1mL 消化液（0.25%胰蛋白酶或 0.02%EDTA 或混合液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用 2～3 分鐘，輕輕搖動，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時應(yīng)立即終止消化。
    (4)加入*培養(yǎng)基 5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機械損傷。
    (5)用計數(shù)板計數(shù)，計算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。
    四、傳代細(xì)胞的建系和維持
    細(xì)胞系的維持通過換液傳代再換液、再傳代和細(xì)胞種子凍存來實現(xiàn)；
    對每一個細(xì)胞系來說都有其自身的特點，要做好建系的維持必須記錄好細(xì)胞檔案,換液傳代和做好細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理工作；
    原代細(xì)胞的純化和克隆
    體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，為了保證實驗結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進行實驗，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實驗研究的重要一步。
    一、細(xì)胞的純化
    細(xì)胞的純化分為(一)自然純化：長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，最后留下生長優(yōu)勢旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。如腫瘤突變細(xì)胞通過此方法建立細(xì)胞系。
    (二)人工純化：利用人為手段造成某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下 5 種方法。
    1．細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長的細(xì)胞系。
    2．酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的。另外對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。
    （1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化
    兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開，
    （2）骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化
    在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上，種類混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開和純化的目的。
    3．機械刮除法
    原代培養(yǎng)時,如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域;
    4．反復(fù)貼壁法
    成纖維細(xì)胞其貼壁過程快，能在短時間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。
    5．電烙篩選法
    在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，可用機械刮除法去除或用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。
    二、細(xì)胞的克隆化
    細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。
    主要的克隆方法有 5 種
    （一）毛細(xì)管克隆法
    （二）有限稀釋克隆法
    （三）平皿克隆分離法
    （四）軟瓊脂克隆分離法
    （五）單細(xì)胞顯微克隆法
    毛細(xì)管克隆法：
    （1）將一定量的細(xì)胞懸液（如 105/mL 或更低）稀釋至 1 個細(xì)胞/mL；
    （2）取 10mL 稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為 0.5mm，長為 8mm 的毛細(xì)玻璃管若干（30～50 只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中；（3）在倒鏡下檢查出每管只進入一個細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；
    （4）在 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個克隆的細(xì)胞群體。
    有限稀釋克隆法：
    (1)取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺
    盼藍(lán)染色計數(shù)，測定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)高于 90%以上）。
    （2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至 50 個細(xì)胞/mL、10 個細(xì)胞/mL、5
    個細(xì)胞/mL，將 3 種稀釋度的細(xì)胞分別接種于 96 孔板中，每孔為 0.1mL，于 37℃5%CO2
    下培養(yǎng)。
    （3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記
    并補加 0.1mL 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
    （4）培養(yǎng)期間，視 pH 值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆
    出現(xiàn)。
    （5）待克隆長至孔底面的 1/3～1/2 時，可用消化法將 96 孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至
    24 孔板中進行擴大培養(yǎng)。
    平皿克隆分離法：
    (1)將對數(shù)生長期細(xì)胞制備單個細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用 0.25%
    胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使 5mL 培養(yǎng)液內(nèi)
    含有 50～200 個細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)大于 90%以上）。
    (2)將上述細(xì)胞懸液迅速移入 60mm 平皿中，在 37℃5% CO2 下培養(yǎng) 1 周或更長。若有明
    顯的克隆形成時方可進行克隆分離，方法有兩種：①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況，標(biāo)記單個克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有
    少量無菌硅脂的無菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量 0.25%胰蛋白酶，待
    細(xì)胞脫離時，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉(zhuǎn)入小平皿或 24 孔板或 6 孔板中擴大培養(yǎng)。
    ②玻片法：在接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在 60mm 平皿中放入無菌小玻片，加入細(xì)胞懸液，培
    養(yǎng)一定時間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個克隆的玻片，然后用無菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)
    入 24 孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。
    軟瓊脂克隆分離法：
    (1)將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液單個細(xì)胞)作活細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×106
    細(xì)胞/L，然后根據(jù)實驗要求再作梯倍稀釋。通常以 1~5×104 個細(xì)胞/L 為佳。
    (2)制備底層瓊脂取 5%瓊脂置沸水中，使瓊脂*溶化，取出一份 5%瓊脂，移入小燒杯中，
    待冷至 50℃，迅速加入 9 份預(yù)溫 37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為 0.5%瓊脂），混勻后立即注入
    24 孔培養(yǎng)板中，每孔含 0.5% 瓊脂 0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。
    (3)制備上層瓊脂取 37℃保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液 9.4mL，移入小燒杯中，加入 50℃
    5% 瓊脂 0.6mL 迅速混勻，即配成 0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的 24 孔培養(yǎng)
    板中，每孔 0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。
    (4)于 37℃5% CO2 下培養(yǎng) 1~2 周或更長，若需培養(yǎng)更長時間可補加 0.8mL/孔含瓊脂的培
    養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。
    (5)集落（克隆）計數(shù)在倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)直徑大于 75μm 或含有 50 個細(xì)胞以上的
    克隆。
    生成克隆數(shù)集落(克隆)形成率(%)= ————————×100%
    每皿接種細(xì)胞數(shù) 單個細(xì)胞的數(shù)目
    單個細(xì)胞百分率(%) = ———————————————×100%單個細(xì)胞數(shù)目+2 個以上細(xì)胞群數(shù)目
    單細(xì)胞顯微克隆法：
    是借助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個細(xì)胞逐個吸出，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中
    進行培養(yǎng)克隆的方法。
    （1）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：
    ①用 0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長的 3T3 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 108 細(xì)胞/L，在 96
    孔板中每孔加入 0.1mL 細(xì)胞懸液于 37℃5% CO2 中培養(yǎng)至單層。
    ②將已形成單層的 3T3 細(xì)胞板，用 60Co γ線以 4000～6000 拉得輻射（終濃度為 10-6mol/L）作用 16h。其目的是使細(xì)胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持 pH 而且還可為克隆細(xì)胞提供必要的養(yǎng)分及刺激生長的因子。
    (2)制備單個細(xì)胞懸液方法同上。
    (3)分離單個細(xì)胞方法多樣，如：
    ①毛細(xì)管吸入法同上述毛細(xì)管法，在顯微鏡下將只有一個細(xì)胞的毛細(xì)管取出。
    ②微滴法將經(jīng)稀釋至 103 個細(xì)胞/L 的單個細(xì)胞懸液，用無菌的 1mL 注射器逐滴加在平皿中
    制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個細(xì)胞的液滴，再用毛細(xì)管取出單個細(xì)胞懸滴。
    ③液體石蠟法將經(jīng)稀釋至 103 個細(xì)胞/L 的單個細(xì)胞懸液，用無菌的 1mL 注射器逐滴加入充
    滿無菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個細(xì)胞液滴，仔細(xì)用毛細(xì)吸管取出
    有一個細(xì)胞的液滴。
    ④玻璃小球附著法將稀釋至 103 個細(xì)胞/L 的細(xì)胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻
    璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個細(xì)胞的玻珠，仔細(xì)用鑷
    子取出。(4)將采用上述方法分離出的單個細(xì)胞，放入預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的 96 孔培養(yǎng)板中，于 37℃
    5% CO2 下培養(yǎng) 1~2 周或更長。
    (5)待細(xì)胞克隆明顯，并使孔底覆蓋 1/3～1/2 時，即可將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于 24 孔板進行擴大培養(yǎng)
    （貼壁細(xì)胞仍需用 0.25%胰酶消化法取出轉(zhuǎn)種）。人或動物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，
    即使采用 1mm3 的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長，若需獲取大量細(xì)
    胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：
    一、懸浮細(xì)胞的分離方法
    組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，較為簡單的方法是采用 1000r/min 的
    低速離心 10 分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，
    以避免擠壓或機械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂 PBS 洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整
    適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因為，
    經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
    不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。
    二、實體組織材料的分離方法
    對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，
    可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。
    (一)機械分散法
    所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織
    細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號針)，使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹
    鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快
    速，但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。
    (二)消化分離法
    組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進一步
    使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打
    分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
    1、酶消化分離法
    酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：
    (1) 胰蛋白酶分散技術(shù)
    胰蛋白酶(簡稱胰酶)是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，
    主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開，在
    常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細(xì)胞的
    作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH 以及消化
    時間的長短等。
    ①細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊
    膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織，如 乳腺、滑膜、子宮、纖維
    肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用，就能增加其對組織的分離作用。
    ②酶的活力 市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過測定而有效，但配制時必須新鮮，需保存在低
    溫冰箱中，消化時的 pH 和溫度都要適宜，否則會影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有
    關(guān)，最終使用活力為 1:200 或 1:250,56℃pH8.0 時活力*。
    該酶為粉劑，保藏時要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時間不能太長，若粉劑結(jié)團塊，說明
    該部分受潮或失效。
    ③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為 0.1%-0.25%(活力 1:200 或 1:250)，但遇到難消化
    的組織時，濃度可適當(dāng)提高，消化時間適當(dāng)延長。濃度高對細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋
    白酶在培養(yǎng)液中可促進細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰
    蛋白酶因子所清除。
    ④溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在 56℃時活性*，但由于對細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為 37℃，通常在 37℃進行消化比室溫作用快。
    ⑤pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分
    散快，細(xì)胞也容易被消化下來，消化分離細(xì)胞時 PH 只能選用 7.6~8.0 之間，否則對細(xì)胞有
    損傷。
    ⑥無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化
    作用。因此，在配制時應(yīng)采用無鈣鎂離子的 PBS 配制。
    ⑦消化時間 如果細(xì)胞消化時間過長，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般
    消化時間為 20 分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于 4℃過夜也可。
    分離方法如下：
    ①過夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右，用 Hanks
    液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織，再加入 0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放 4℃過夜，次日
    再用 Hanks 液洗滌，棄去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計數(shù)，
    按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
    ②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：
    熱消化多次提取--將剪碎的細(xì)胞塊加入 0.25%胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分鐘，然后
    經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未*消化的
    組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。
    冷消化多次提取--方法同上，只是消化溫度為 4℃。
    先熱消化后冷消化--將組織塊先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散，
    制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于 4℃下過夜，次日再提取細(xì)胞，分散成
    懸液，分瓶培養(yǎng)。
    (2) 膠原酶(Collagenase)消化法膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上
    皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠
    原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用 PBS
    和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度 200u/mL 或
    0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加
    實驗成本。
    經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團塊尚未
    被*消化開。成小團塊的上皮細(xì)胞比分散的單個上皮細(xì)胞更易生長，因此不必要再進一步
    消化處理。
    鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見表 4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時
    間(小時)有差異(見表 4-2)，以及兩者價格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時還
    可加透明質(zhì)酸酶(對細(xì)胞表面糖基有作用)，采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、
    癌組織非常有效。
    表 4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
    項 目
    胰蛋白酶
    膠原酶
    消化特性
    適用于消化軟組織
    適用于消化纖維多的組織
    用 量
    0.01%~0.5%
    0.1~0.3mg/mL（200u/mL）
    消化時間
    0.5~2 小時（小塊）
    1~12 小時
    pH
    8~9
    6.5~7.0
    作用強度
    強烈
    緩和
    細(xì)胞影響
    時間過長有影響
    無大影響血清、鈣、鎂離子 有影響
    無影響
    表 4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間(小時)(0.5~1cm3)
    酶 種 類
    較 硬 組 織
    軟 組 織
    4℃ 室 溫 37℃
    4℃ 室 溫 37℃
    胰蛋白酶（0.25%）
    24~48 1~6
    1~2 12~24 1~2 0.5~1
    膠原酶（200u/mL）
    24
    6
    6.5
    12
    3
    0.25
    兩者聯(lián)合（對沖）
    12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2
    除上述兩種較為常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋
    白酶，近年來，還有一種從灰霉菌中提取的 Pronase 新酶分散細(xì)胞更佳。
    2、非酶消化法(EDTA 消化法)
    EDTA 是一種非酶消化物，又稱螯合劑或 Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂
    離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)
    能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使
    貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常
    不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用(1:1 或 2:1)，不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可
    降低胰酶的用量和毒性作用。
    消化分離法的操作步驟：
    (1)剪切 把組織塊剪碎，呈 1~5mm3 大小的組織塊。
    (2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂 PBS 洗 2-3 次(采用傾斜，自然沉
    降法)。
    (3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA)于 37℃水浴中作用適當(dāng)時間(中間可輕搖
    1~2 次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。
    (4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
    (5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗 2-3 次
    后，加入*培養(yǎng)基。
    (6)機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或 3~4 層無菌紗布過濾后
    分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。
    注意事項如下：
    (1)組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作
    用。
    (2)胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
    (3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)
    胞隨漂洗而丟失。
     
     

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