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    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    發(fā)布時間： 2021-09-16　　點擊次數(shù)： 3239次

    在分子生物學(xué)中，未知基因全長序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列時，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等等......


    背景介紹

    今天我們來一起了解一種可從低豐度轉(zhuǎn)錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時，就可以通過RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長的技術(shù)，RACE具有簡單、快速、廉價的優(yōu)勢，因而得到較多的運用。


    RACE是什么？

    RACE全稱為rapid amplification of cDNA end，即cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，就是已知部分cDNA序列，基于mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)獲得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物學(xué)技術(shù)。


    RACE可以應(yīng)用在哪些實驗方向？

    構(gòu)建cDNA文庫

    lncRNA全長克隆

    獲得抗體可變區(qū)序列

    miRNA靶基因序列驗證

    已知基因一段序列，克隆旁側(cè)序列

    獲得病毒基因組

    ......

    總體來說，就是用來測定cDNA序列，獲得RNA全長序列。


    RACE技術(shù)類型及特點？

    RACE技術(shù)有多種類型，根據(jù)各個RACE技術(shù)原理的不同，適合于不同的RNA，快來跟著小編一起來了解下吧~

    經(jīng)典RACE

    經(jīng)典RACE技術(shù)是在1988年由Frohman等[1]發(fā)明。經(jīng)典RACE技術(shù)包括5'RACE和3'RACE，分別克隆cDNA的5'端和3'端。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A結(jié)構(gòu)的特點，使用5'端帶有接頭序列的oligo dT與之結(jié)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；

    2. 再利用根據(jù)已知序列設(shè)計的上游引物和與接頭序列互補(bǔ)配對的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA 3'末端擴(kuò)增產(chǎn)物。

    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 經(jīng)典RACE技術(shù)中的5'RACE是利用根據(jù)已知序列設(shè)計的下游引物GSP作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成一鏈cDNA；

    2. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A；

    3. 帶有接頭序列的Oligo dT引物與一鏈cDNA 3'末端的poly A結(jié)合，合成二鏈cDNA；

    4. 再以第二鏈cDNA為模板，利用GSP和接頭引物作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA 5'末端擴(kuò)增產(chǎn)物；

    得到的5'末端產(chǎn)物和3’末端產(chǎn)物可以通過克隆連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，進(jìn)行測序獲得末端序列。將測序得到的cDNA末端序列，與已知的中間序列進(jìn)行拼接，就可獲得cDNA全長序列。


    經(jīng)過科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由經(jīng)典RACE又衍生出多種RACE技術(shù)，增加了RACE技術(shù)的適用廣泛性，我們再來一起了解下其他的RACE技術(shù)吧！

    Cap-switching RACE

    Cap-switching RACE針對mRNA發(fā)生斷裂的可能，進(jìn)行了技術(shù)優(yōu)化[2-4]。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. Cap-switching RACE是以O(shè)ligo dT作為逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA；

    2. 當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)時，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）會在新合成的cDNA的3'末端加上若干個胞嘧啶；

    3. 接著，使用5'端帶有接頭、3'端帶有poly G結(jié)構(gòu)的接頭引物與cDNA 3'端的poly C互補(bǔ)配對，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)以接頭為模板合成cDNA，完成接頭轉(zhuǎn)化，新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列；

    4. 然后再利用接頭引物進(jìn)行PCR獲得RACE產(chǎn)物。

    RLM-RACE

    RLM-RACE技術(shù)的出現(xiàn)同樣也是為了擴(kuò)增到完整mRNA的5'末端，避免mRNA斷裂帶來的影響。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶（CAP），特異性地識別并切除斷裂mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)；

    2. 再向體系中加入煙草酸焦磷酸酶（TAP），切除mRNA 5'端完整的帽子結(jié)構(gòu)，使mRNA 5'端暴露出一個磷酸基團(tuán)；

    3. 接著加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)連接，而切除了磷酸基團(tuán)的斷裂RNA則不能與接頭結(jié)合，這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA；

    4. 最后再進(jìn)行RT-PCR。

    Adapter-Ligated RACE

    Adapter-Ligated RACE技術(shù)同樣是為了獲得更長的mRNA序列，但相對來說不一定能獲得全長mRNA序列[5]。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 向逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA體系中加入T4連接酶，利用T4連接酶將接頭連接到cDNA兩個末端上；

    2. 短cDNA的退火溫度低，兩端接頭容易發(fā)生退火，形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)；

    3. 長的cDNA退火溫度高，不易形成鍋柄裝結(jié)構(gòu)，因此引物可以與接頭結(jié)合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


    環(huán)形-RACE

    環(huán)形-RACE使用一對基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，提高了PCR擴(kuò)增的特異性[6]。

    1. 環(huán)形RACE是利用T4連接酶將cDNA的末端連接，形成cDNA的環(huán)化結(jié)構(gòu)或串聯(lián)結(jié)構(gòu)；

    2. 根據(jù)mRNA上的已知區(qū)域設(shè)計特異性引物GSP，以GSP引物合成第二條cDNA鏈；

    3. 在未知序列兩端根據(jù)已知序列設(shè)計一對GSP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將未知序列置換到已知序列中間位置，得到中間是未知序列、兩端是已知序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。



    RCA-RACE

    RCA-RACE (rolling circle amplification rapid amplification of cDNA ends)類似于環(huán)形RACE，但是RCA-RACE在環(huán)化的過程中并不會產(chǎn)生串聯(lián)結(jié)構(gòu)，PCR擴(kuò)增過程中所使用的引物既可以是特異性引物，也可以是隨機(jī)引物。PCR擴(kuò)增使用φ29聚合酶，這種酶的特點是會把酶前行方向上的前鏈從原來的模板鏈上進(jìn)行解鏈、移開。RCA-RACE利用這種特點，可以讓模板上的每個點在第一輪反應(yīng)中，都有機(jī)會得到n個拷貝，產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。

    RCA-RACE利用ATP依賴性的熱穩(wěn)定連接酶，將一條cDNA末端的5'磷酸基團(tuán)和3'羥基連接，形成單分子環(huán)狀DNA。再使用隨機(jī)引物或基因特異性引物，在φ29 DNA聚合酶的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)增長。


    RACE的技術(shù)特點對比

    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    基于RACE技術(shù)原理，以下幾點可提高RACE實驗的成功率：

    1. 保證RNA模板的完整性。實驗之前最好進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性。

    2. 使用高特異性引物。如使用Vazyme的RACE引物設(shè)計軟件，軟件會給出多條合適的RACE引物，可選擇多條基因特異性引物進(jìn)行RACE實驗，提高成功率。


    3.巢式PCR。應(yīng)用巢式PCR設(shè)計引物時，在引物中加入特異性序列和適當(dāng)?shù)拿盖形稽c，一方面可以增加對目的片段的特異性克隆，另一方面也方便后續(xù)的測序和實驗


    安培可以提供

    HiScript-TS 5'/3' RACE Kit（Vazyme #RA101）基于Cap-switching RACE原理開發(fā)，試劑盒中包括5'RACE和3'RACE的所有組分，可分別獲得5'RACE和3'RACE的產(chǎn)物。

    原理圖如下：


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    成功率高：經(jīng)測試RA101陽性率可達(dá)到70 %以上

    操作流程簡便、體驗感優(yōu)：步驟簡化，一管內(nèi)完成模板轉(zhuǎn)換和一鏈cDNA合成；組分Mix形式，減少加樣步驟、降低加樣所帶來的污染

    配套RACE引物設(shè)計軟件和序列比對軟件：包含RACE實驗引物設(shè)計軟件和序列比對軟件，以及使用說明文件，簡化RACE實驗設(shè)計環(huán)節(jié)


    【參考文獻(xiàn)】

    [1] Frohman M A，Dush M K，Martin G R． Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide prime［J］． Proc． Nat． Acad． Sci． USA，1988，85( 23) : 8998 － 9002．

    [2] Matz M，Shagin D，Bogdanova E，et al． ． Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR［J］． Nucl． Acid Res． ，1999，27( 6) : 1558 － 1560．

    [3] Schramm G，Bruchhaus I，Roeder T． A simple and reliable 5- RACE approach［J］． Nucl． Acid Res． ，2000，28( 22) : e96．

    [4] Schmidt W M，Mueller M W． CapSelect: a highly sensitive method for 5'CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs［J］． Nucl． Acid Res． ， 1999，27( 21) : e31．

    [5] Chenchik A，Diachenko L，Moqadam F，et al． ． Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5' and 3' ends by amplification of adaptor-ligated cDNA［J］． Biotechniques， 1996，21( 3) : 526 － 535．

    [6] Maruyama I N，Rakow T L，Maruyama H I． cRACE: a simple method for identification of the 5' end of mRNAs［J］． Nucl． Acid Res． ，1995，23( 18) : 3796 － 3797．

    [7] 徐燁, 劉雅婷, 代文瓊,等. 幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2012, 014(002):81-87.



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