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    從大鼠肝臟制備微體的方法

    發(fā)布時間： 2021-11-16　　點擊次數(shù)： 1016次

    材料與儀器

    雄大鼠
    蔗糖 蔗糖 HM
    玻璃板

    步驟

    1. 用斷頸法殺死約 150 g 重的雄大鼠，大鼠的數(shù)量取決于要制備的粗微體的數(shù)量。由于一個 150 g 重的大鼠肝（6 g）大約每克肝蛋白含有 10 mg 粗微體，所以大鼠的數(shù)量可以以回收率為 50% 來進行估計。

    2. 流干血液后，打開腹部和胸腔，切取肝，將它們放在盛有冰冷勻漿介質的燒杯中：

    勻漿介質（HM）：

    0.5 mol/L 蔗糖

    1 mmol/L DTT

    3. 用冰冷 HM 沖洗大鼠肝，將它們放在紙巾上，如果有結締組織去掉之，迅速稱重。

    4. 將肝放在干凈的玻璃板上，用剃須刀片將其切成盡可能小的碎片，直到形成漿糊樣稠狀物。當肝在小燒杯里用剪刀剪碎時，不加HM 要容易些，因為 HM 妨礙剪切。

    5. 將切碎的肝放入盛有 4~5 倍體積冰冷 HM 的燒杯中，輕輕混旋，等碎片沉到底部后去掉液體以去除血液。

    6. 4 倍體積的 HM 在配套寬松的 Dounce 勻漿器（帶兩個研杵的 40 ml Dounce 勻漿器）中輕輕杵擊 5~10 次（上下各一次為一次杵擊），或者在 Potter-Elvdijem 玻璃/Teflon 勻漿器（0.04~0.06 英寸清除率；Kontes）中用馬達帶動的 Teflon 研杵以 1700 r/min 的速率勻漿（5~10 次杵擊），將勻漿物保持在冰水里。

    7. 將勻漿物經(jīng)過 4~6 層用 HM 預先濕潤過的干酪紗布過濾到刻度量筒中。過濾結束后，將沙布的邊沿合到一塊，慢慢地從口部到底部擠壓袋子。

    8. 將勻漿物體積增加到肝重量的 5 倍，用石蠟封口膜蓋注，倒轉量筒數(shù)次以混勻勻漿物。

    9. 在 Sorvall 低溫冷凍離心機的 SS34 轉頭中 2500 r/min 離心勻漿物 5 分鐘，然后提高速度到 15000 r/min（最大 23000 g）離心 15 分鐘。

    10. 用紙巾、吸管或注射器和金屬針頭將表面的一層白色東西吸去，然后用注射器和金屬針頭將上清（PMS ) 轉移到刻度量筒中。

    11. 用 PMS 和 2.5 mol/L 蔗糖制備三種蔗糖溶液。

    (1) 1.35 mol/L 含 PMS 的蔗糖（用 1 體積的 PMS 和 0.7 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合制備）

    (2) 1.55 mol/L 含 PMS 的蔗糖（用 1 體積的 PMS 和 1.1 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合制備）

    (3) 1.8 mol/L 含 PMS 的蔗糖（用 1 體積的 PMS 和 2 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合制備）

    12. 用第 11 步制備的溶液在 Ti60 轉頭（Beckmanlnslrmnents) 的超離心管中制備分級梯度。自上而下鋪上 5 ml 1.8 mol/L 蔗糖-PMS、3 ml 1.55 mol/L 蔗糖-PMS、15~17 ml 1.35 mol/L蔗糖-PMS，最后是 2~3 ml 1 mol/L 蔗糖溶液。

    13. 4℃ 48000 r/min（最大 240000 g）離心至少 6 小時。

    14. 用注射器和金屬針頭收集沉降在 1.55 mol/L 蔗糖溶液的兩條帶或一條彌散帶中的膜結構，這就是粗微體部分，可以用于以后的各種目的。

    15. 制備 TKM 緩沖液和高速離心上清（HSS）

    (1) 制備 TKM 緩沖液

    ① TKM 緩沖液

    50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)

    50 mmol/L KCl

    5 mmol/L MgCl2

    ② TK20M 緩沖液

    50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

    50 mmol/L KCl

    20 mmol/L MgCl2

    (2) 用 2 倍體積 0.25 mol/L 蔗糖-3 mmol/L DTT 或 0.25 mol/L 蔗糖-TKM- 3 mmol/L DTT 溶液勻漿切碎的肝。

    (3) 15000 r/min 離心勻漿物 15 分鐘，取出并保存上清。

    (4) 上清在 Ti60 轉頭中 4℃ 45000 r/min ( 最大 200000 g ) 離心 60 分鐘。

    (5) 取出并去掉最上面的脂肪層，從上面取出 4/5 的液體作為內(nèi)源性 RNase 抑制劑(HSS)，分裝并保存在 -70℃。

    (6) 如果要進行體外翻譯，用 G100 凝膠層析柱從大鼠肝 HSS 中制備 G100 部分。

    16. 按下列方法處理粗微體部分。

    (1) 制備膜結合多聚核糖體

    ① 用含 HSS ( 20% v/v) 的 TK20M 將粗微體部分稀釋 3 倍，與 Triton X-100 和 DOC ( 終濃度分別為 1% 和 0.5% ) 混合，放冰上 10 分鐘。

    ② 將混合物鋪在制備于 Ti60 轉頭離心管中的分級梯度上，該梯度（自下而上）含有 5 ml 2.0 mol/L 含有 HSS (10% v/v) 或人胎盤核糖核酸酶抑制劑 ( 2~4 U/ml ) 的蔗糖-TK20M 溶液、3 ml 1.55 mol/L 含有 HSS (10% v/v) 的蔗糖-TK20M 溶液和 15~18 ml 去污劑處理的粗微體部分。

    ③ 4℃ 44000 r/min ( 最大 200000 g）離心梯度 14~16 小時。

    ④ 將上清倒掉，立即用 3~5 ml TKM 沖洗離心管的內(nèi)管壁（將緩沖液加到管壁上而不要直接加到多聚核糖體沉淀上，輕輕混旋并棄掉上清)。將離心管倒立在干凈紙巾上數(shù)分鐘，用 Kimwipe 紙巾輕察內(nèi)管壁，保存在 -70℃ 待用。

    (2) 用粗微體進行體外 35S 甲硫氨酸摻入

    ① 要濃縮粗微體，用含 HSS ( 10% v/v) 的 TKM 稀釋粗微體 4 倍，在 SW41 轉頭的離心管里準備（自下而上）含有 1 ml 含 HSS 的 1.8 mol/L 蔗糖-TKM，1 ml 含 G100 部分的（20% v/v ) 的 1.3 mol/L 蔗糖-TKM 和 2 ml 含 HSS (10% v/v ) 的 0.7 mol/L 蔗糖-TKM 的梯度，在該梯度上鋪 8 ml 稀釋的粗微體。

    ② 4℃ 35000 r/min ( 最大 210000 g）離心梯度 60 分鐘。

    ③ 收集在 1.8 mol/L 和 1.3 mol/L 蔗糖界面之間形成的條帶，體積要盡可能小以免降低微體的濃度，立即用于 G100 系統(tǒng)的翻譯（Gaetani et at.1983)。

    (3) 對于不要求完整的膜結合多聚核糖體的實驗

    ① 用 TKM 稀釋粗微體 3 倍，在 Ti60 轉頭中 4℃ 40000 r/min ( 最大 160000 g）離心 60 分鐘。

    ② 倒掉上清，將管子立于一疊紙巾上數(shù)分鐘，用 Kimwipe 紙巾輕擦內(nèi)壁，保存于 -70℃ 待用。


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