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    細(xì)胞勻漿的操作

    發(fā)布時(shí)間： 2021-11-24　　點(diǎn)擊次數(shù)： 3376次

    材料與儀器

    細(xì)胞
    緩沖鹽溶液 二異丙基氟瞬酸 勻漿緩沖液
    相差顯微鏡

    步驟

    1. 準(zhǔn)備下面的貯液和材料。

    等滲的緩沖鹽溶液（例如 PBS，150 mmol/L NaCl；10 mmol/L NaPO4，pH 7.2)

    二異丙基氟瞬酸（DIFP）

    1 mol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

    0.5 mmol/L K+EGTA，pH 7.0

    0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0

    0.1 mol/L DTT

    NaN3

    蛋白酶抑制劑

    PMSF

    抑胃酶肽 A

    亮抑酶肽

    刀豆胰蛋白酶抑制劑

    勻漿緩沖液：

    0.34 mol/L 蔗糖

    20 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

    5 mmoI/L K+EGTA，pH 7.0

    5 mmol/L K+ATP，pH 7.0

    5 mmol/L DTT ( 干粉或用貯存液）

    50 μmol/L PMSF

    3 mmol/L NaN3

    22 μmol/L 抑胃酶肽 A

    1.2 μmol/L 亮抑酶酞

    10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制劑

    PMSF 可以用 pAPMSF 代替，它更穩(wěn)定，但更貴。

    2. 洗細(xì)胞：輕輕地沉降細(xì)胞（例如 3000 g 離心 5 分鐘），去掉培養(yǎng)基，通過(guò)振搖打碎沉淀物，然后重懸于至少 10 倍體積冰冷的等滲緩沖鹽水中。再次在新鮮的等滲緩沖鹽水中沉降和重懸，總共 3 次。對(duì)于不同的細(xì)胞類型，離心力和時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行優(yōu)化。

    3. 最終的冰冷的細(xì)胞懸液中補(bǔ)加 DIFP，使終濃度為 5.7 mmol/L（每毫升細(xì)胞懸液中加 1 μl）。冰浴 5 分鐘。

    4. 上述的步驟 2 沉降細(xì)胞，然后重懸于 4~6 倍勻漿緩沖液中。

    5. 細(xì)胞勻漿要造成最大破壞，但要盡量減少氧化。

    6. 用相差顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的裂解，證實(shí)超過(guò) 99% 都已經(jīng)裂解了。


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