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    Real-time PCR實(shí)驗(yàn)攻略（基本方法一）

    發(fā)布時(shí)間： 2022-03-11　　點(diǎn)擊次數(shù)： 4393次

    材料與儀器



    步驟


    實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）實(shí)驗(yàn)流程
     
    一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉(zhuǎn)錄)
     
    不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因?yàn)镽eal-Time PCR對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實(shí)驗(yàn)前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
     
    在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測(cè)，如果存在DNA污染時(shí)，要用DNase I進(jìn)行消化（因?yàn)樵谔幚磉^程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑）
     
    二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA
     


    三、RNA瓊脂糖凝膠電泳
     
    1.  1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：
     
    1） 稱取瓊脂糖0.45 g放入三角瓶中，向其中加入4.5 ml的10×MOPS緩沖液和39.5 ml的DEPC水，放微波爐里溶化。
     
    2） 待冷卻到60攝氏度左右時(shí)，加入1 ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。倒入凝膠板上凝固30 min。
     
    2.  取各個(gè)RNA樣品4 μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μl混勻，加入變性膠加樣孔中。
     
    3.  120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。
     



    另外還有一種RNA檢測(cè)方法：
    濃度檢測(cè)：取4 μl RNA，加蒸餾水至1 000 μl，混勻。測(cè)OD260、OD280
     
    四、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
     
    反轉(zhuǎn)錄程序(以MBI的M-MLV為例)



     
    反轉(zhuǎn)錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計(jì)的要求
     
    1）隨機(jī)六聚體引物：
    當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長(zhǎng)序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長(zhǎng)mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

    2）Oligo(dT)：
    是一種僅對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特別適合檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測(cè)稀有基因是否表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測(cè)特定mRNA的表達(dá)水平。

    3）特異性引物：
    最特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3'端最靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。
    做 Real Time PCR時(shí)，用于SYBR Green I/Eva Green 法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求：
     
    ① Tm=55-65 ℃
     
    ② GC=30-80%
     
    ③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300 bp之間都可。
     
    ④ 引物的退火溫度要高，一般要在 60 ℃以上。
     
    要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
    至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不易。
     
    五、cDNA與引物質(zhì)量檢測(cè)
    取0.2 ml薄壁PCR管，編號(hào)。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10 ul；加入正反向引物各0.5 ul（引物濃度10 uM） ，向管中加入混合的cDNA各1 ul。各管補(bǔ)加水至20 ul。
    組份                   加量 
    2×PCRTaqMix  10 ul 
    10 uMPrimer FW  0.5 ul 
    10 uMPrimer RV  0.5 ul 
    Template DNA  1 ul 
    ddH2O 混勻至20 ul 
     
    混勻，置于TP600PCR儀中。95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃35 s ，40 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃ pause。
    取擴(kuò)增產(chǎn)物各8 μl，DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)5 μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀察。
     
    選擇特異性好，擴(kuò)增效率高的引物作為實(shí)時(shí)熒光使用引物。
     
    六、利用相對(duì)定量的方法分析目的基因表達(dá)量的情況
    由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因，目的基因和一個(gè)看家基因。
     
    七、定量 PCR檢測(cè)
    取0.2 ml薄壁PCR管，分別編號(hào)。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5 ul，10 uM各基因正反向引物混合物0.5 ul，對(duì)應(yīng)的cDNA各1 ul。一管中不加模板用作陰性對(duì)照。各管補(bǔ)加水至25 ul。


     
    混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預(yù)變性后，95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測(cè)），40 cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴(kuò)增設(shè)成一個(gè)溫度，只在擴(kuò)增出現(xiàn)問題時(shí)才會(huì)考慮設(shè)梯度。
     
    （侯哥論文中的：95 °C 10分鐘→95 °C 15秒→60 °C 1分鐘；40個(gè)循環(huán)。）
     
    以雙△Ct值法計(jì)算靶基因相對(duì)表達(dá)水平：
     
    GRP78相對(duì)表達(dá)水平=2-△(△CT)
     
    注：△CT =Ct(GRP78)-Ct(GAPDH); △(△CT)= △CT (LLLI)- △CT (contro1)。
     
    如果在熒光背景信號(hào)階段出現(xiàn)很多拐點(diǎn)，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì)；
    如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
    如果引物二聚體存在則陰性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免；
    若是陰性對(duì)照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用。
     
    在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：
     
    ① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個(gè)，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計(jì)引物；
     
    ② 在做基因表達(dá)差異時(shí)容易出現(xiàn)DNA被擴(kuò)增峰（只在引物跨內(nèi)含子時(shí)存在），出現(xiàn)原因是提取RNA時(shí)存在DNA污染，可以通過電泳驗(yàn)證，這時(shí)要重新消化RNA樣品中的DNA；
     
    ③ 擴(kuò)增非特異，這時(shí)要重新摸擴(kuò)增條件或重新設(shè)計(jì)并驗(yàn)證引物。
     
    八、表達(dá)差異的計(jì)算方法
    絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異之間的表達(dá)差異。
     
    2-△△CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法。
     
    在有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達(dá)量增加2.5倍比說該基因的表達(dá)從1000 拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。
     
    2-△△CT方法的推導(dǎo)（詳見實(shí)時(shí)定量PCR和2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量）
     
    補(bǔ)充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對(duì)樣品重新進(jìn)行氯仿抽提，具體實(shí)驗(yàn)流程如下：
     
    消化后總體積100 ul，體積太少，不利于抽提，我們往往補(bǔ)加200 ulDEPC水。
     
    1. 向離心管中加入等體積氯仿（約300 ul） ，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14 000 rpm離心8 min，取上清（約250 ul）。
     
    2. 加入1/10體積的NaAC（3 M）（約25 ul）和預(yù)冷的等體積異丙醇（約280 ul），-20℃放置20 min。
     
    3. 4℃14 000 rpm離心15 min，去上清，注意不要觸到沉淀。
     
    4. 加入1 ml的75%乙醇，4℃14 000 rpm離心3 min，去上清。
     
    5. 瞬時(shí)離心，用200 ul（或10 ul）的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)（勿吸到管底的沉淀）。
     
    6. 把離心管放置于超凈臺(tái)晾至約5-10 分鐘（勿*干燥，否則很難溶）。加入30~50 μl的無(wú)RNase的水，靜止1 min 后，振蕩30sec，瞬時(shí)離心。
     
    7. 將提取的RNA立即進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，或放-20 ℃保存。


    注意事項(xiàng)


    北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院心外科心血管病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吳益和分享
    實(shí)驗(yàn)中必須堅(jiān)持的一些好習(xí)慣
    1. 加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長(zhǎng)了濃度不均。
    2. 移液槍用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。
    3. 所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
    一、防止RNA酶污染的措施
    1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180 ℃的高溫下干烤6 h或更長(zhǎng)時(shí)間。
    2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
    3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10 min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
    4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37 ℃處理12 h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。
    5. 操作人員戴一次性口罩. 帽子. 手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。
    6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。
     

     


    同實(shí)驗(yàn)其他方法

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

    一、 樣品RNA的抽提 1. 取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。 2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后

    Real-time PCR實(shí)驗(yàn)攻略（基本方法二）

    二、DEPC處理方法如下1. DEPC處理（1）DEPC水：100 ml超純水加入0.2 ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。（2） Tip頭(槍頭）. EP管等在提RNA過程中及做RT時(shí)接觸RNA的


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