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    293T細(xì)胞如何才能養(yǎng)得好?

    發(fā)布時(shí)間: 2022-04-13  點(diǎn)擊次數(shù): 2116次
     名稱
     293T [HEK-293T] (人胚腎細(xì)胞) 
     形態(tài)
     上皮樣
     致瘤性
     +
     產(chǎn)物或抗原
     大T抗原
     生長(zhǎng)特性
     貼壁細(xì)胞
     營(yíng)養(yǎng)體系
     DMEM+10%FBS

    圖片


    來(lái)源:ATCC


    293 [HEK-293]細(xì)胞是經(jīng)人腺病毒5(Ad5)轉(zhuǎn)染而形成的人胚腎細(xì)胞永生化細(xì)胞系,293細(xì)胞包含并表達(dá)轉(zhuǎn)染的Ad5基因。


    293T細(xì)胞是293 [HEK-293]細(xì)胞株插入了SV40 T-antigen的溫度敏感基因形成的高轉(zhuǎn)衍生株,廣泛用于病毒包裝。其有多種衍生株,比如HEK293,293T/17等,來(lái)源都是人胚胎腎細(xì)胞,其極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體,且比較容易轉(zhuǎn)染,是一個(gè)很常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株。


    293T細(xì)胞廣泛應(yīng)用于病毒包裝,用磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)50%。蛋白表達(dá)水平高,轉(zhuǎn)染后2-3天用堿性磷酸酶分析可較容易地檢測(cè)到表達(dá)的蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是過(guò)表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外(分泌的或膜上)蛋白的便捷方式。



    細(xì) 胞 特 性  .VivaCell


    1. 貼壁性差

      對(duì)貼壁因子很有要求,最好進(jìn)行包被;也可以提高血清比例來(lái)嘗試觀察一下;注意板材的親水性,細(xì)胞貼壁疏松,可只用EDTA消化,不要用胰蛋白酶過(guò)度消化。


    2. 增殖迅速

      細(xì)胞增殖非???,通常倍增時(shí)間不到一天,隔天即可長(zhǎng)滿,融合率不可過(guò)高,需要及時(shí)傳代。



    培 養(yǎng) 難 點(diǎn)  .VivaCell

     細(xì) 胞 聚 團(tuán) 嚴(yán) 重 

    1. 為啥293T細(xì)胞傳代后聚團(tuán)嚴(yán)重?

    圖片

    經(jīng)傳代后嚴(yán)重聚團(tuán)的293T細(xì)胞

    圖片來(lái)源于客戶僅供參考


    原因推斷:胰酶消化操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)。

    • 消化過(guò)度或吹打過(guò)猛導(dǎo)致細(xì)胞受傷嚴(yán)重,破損的細(xì)胞碎片容易粘連聚團(tuán)。

    • 消化時(shí)細(xì)胞融合率太高,成片脫落,將不容易被吹散,容易聚團(tuán)。


    解決辦法:鑒于該細(xì)胞貼壁疏松,普通0.25%胰酶消化時(shí)間控制15s-30s;吹打動(dòng)作輕柔,控制在10-20次;細(xì)胞融合率達(dá)到80%傳代即可傳代,不可長(zhǎng)的太滿。


    2. 為啥293T換了血清批次后聚團(tuán)嚴(yán)重?

    圖片

    換血清批次后嚴(yán)重聚團(tuán)的293T細(xì)胞

    圖片來(lái)源于客戶僅供參考


    原因推斷:血清來(lái)源于動(dòng)物,其組成成分有1000種左右,且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏哪挲g、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件而異。每個(gè)批號(hào)的組分百分比含量都是不固定的,所以批間差異是存在的。293T細(xì)胞本身有聚團(tuán)生長(zhǎng)特性,但嚴(yán)重聚團(tuán)可能受到血清里的某些因子刺激。


    解決辦法:先用血清試用裝,試用效果好,可購(gòu)買(mǎi)和血清試用裝批次相同的正裝,囤積半年或一年的用量,有效避免批間差對(duì)細(xì)胞的影響(胎牛血清在-20℃保存可達(dá)5年)。


     貼 壁 性 差 

    1. 為什么用了新批號(hào)的血清,293T細(xì)胞貼壁性變差?

    圖片

    貼壁疏松的293T細(xì)胞

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    原因推斷:血清存在批間差異,而293T細(xì)胞本身特點(diǎn)就是貼壁性差,對(duì)不同批次的血清適應(yīng)性不同,就容易出現(xiàn)貼壁疏松現(xiàn)象。


    解決辦法:可適當(dāng)加高血清比例(最高不超過(guò)20%);建議試好一個(gè)血清批次多囤一些,可以避免血清批間差對(duì)細(xì)胞的影響。


    2. 為啥293T細(xì)胞從瓶里(例如T25)鋪板到孔里(96孔板),貼壁性變差?

    原因推斷:排除掉瓶和孔板本身材質(zhì)或TC(親水處理)處理因素外,293T細(xì)胞貼壁性變差極有可能是因?yàn)榭臻g的隔離導(dǎo)致細(xì)胞自分泌或旁分泌產(chǎn)生的信號(hào)分子濃度太低,不利于細(xì)胞的貼壁或增殖。


    解決辦法:在鋪板前,對(duì)孔板進(jìn)行明膠包被,可有效促進(jìn)細(xì)胞貼壁。


     轉(zhuǎn) 染 病 毒 后 細(xì) 胞 凋 亡 嚴(yán) 重 

    1. 為啥293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后凋亡嚴(yán)重?

    圖片

    經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后漂浮凋亡的293T細(xì)胞

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    原因推斷:在排查了方法步驟和轉(zhuǎn)染試劑,依然沒(méi)有改善的情況下,可排查一下轉(zhuǎn)染前的營(yíng)養(yǎng)體系,尤其是血清批間差帶來(lái)的影響。很多同學(xué)說(shuō)前期培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)正常呀,其實(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)只是鑒別細(xì)胞是否健康的一個(gè)外在指標(biāo),還要結(jié)合細(xì)胞其它指標(biāo)對(duì)細(xì)胞健康進(jìn)行評(píng)定(比如倍增時(shí)間,存活率)。


    解決辦法:通過(guò)更換血清批次,再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并觀察轉(zhuǎn)染后的效果,比較分析出原因。


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