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    染色體制備

    發(fā)布時間： 2022-12-13　　點擊次數(shù)： 1212次

    原理

    固定阻滯于分裂中期的細胞，在低滲液中膨脹，將細胞滴在載玻片上，染色，觀察 [ Rothfels and Siminovitch，1958；Rooney and Czepulkowski，1986 ] 。

    材料與儀器

    D-PBS 0.25%胰蛋白酶 對數(shù)期的培養(yǎng)細胞 秋水仙酰胺
    低滲溶液 醋酸甲醇固定液 Giemsa染液 DPX或Permount封固劑 冰
    離心管 巴斯德吸管 載玻片 蓋玻片 載玻片盒 低速離心機 渦流混懸器

    步驟

    1. 將 2× 104~ 5× 104 個細胞 /ml （4× 103~ 1× 104 個細胞 /cm2） 20 ml 在 75 cm2  的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

    2. 約 3.5 天后，細胞處于對數(shù)生長期時，將 0.2 ml 的 1×10-5 mol/L 的秋水仙酰胺（用 D-PBSA 配制）加入培養(yǎng)瓶內(nèi)已有的培養(yǎng)基中，終濃度 1×10-7 mol/L 。

    3. 4~6 小時后，輕輕去掉培養(yǎng)基，加 5 ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育 10 min。

    4. 在胰蛋白酶液中離心細胞，棄掉上清胰蛋白酶。

    5. 以 5 ml 低滲溶液（0.04 mol/L KCl ; 0.025 mol/L 枸櫞酸鈉）重新混懸細胞，37℃ 下靜置 20 min 。

    6. 加入等量新鮮配制的冰冷的醋酸甲醇（一份冰醋酸加三份無水甲醇或乙醇，新鮮配置并在冰上保存），不停地混合，然后以 100 g 速度離心 2 min。

    7. 棄掉上清混合物，在渦流混懸器上震蕩細胞團塊，再慢慢邊混勻邊加新制備的醋酸甲醇。

    8. 細胞在冰上靜置 10 min。

    9. 以 100 g 速度離心細胞 2 min 。

    10. 棄掉上清醋酸甲醇，以 0.2 ml 的醋酸甲醇溶液，重新振蕩混懸細胞團，直到細胞均勻分散。

    11. 用吸管吸一滴細胞懸液到吸管尖部，從約 12 英寸（30 cm） 處滴到?jīng)龅牟Ｆ?，傾斜玻片，讓液滴流下并鋪開。

    12. 將玻片在燒杯沸水上迅速干燥，然后用相差顯微鏡觀察。如果細胞均勻鋪展而沒有相互接觸，則以同樣濃度的細胞制備更多片子。如果細胞成堆重疊出現(xiàn)，則稀釋懸液 2~4 倍之后，再制備一張滴液玻片。如果滿意，就制備更多片子，若不滿意，重復(fù)這一步驟進一步稀釋。

    13. 進行 Giemsa 細胞染色：

    (a)將玻片放在架子上，架子放在水池上。

    (b)以數(shù)滴純 Giemsa 染液完-全覆蓋玻片，染色 2 min 。

    (c)以約 10 倍體積的水淹沒玻片。

    (d)再靜置 2 min。

    (e)用流動水沖掉稀釋過的染液。

    (f) 最后用水逐張沖洗玻片去除染液沉淀。

    (g)顯微鏡下觀察染色情況，如果滿意，則將載玻片徹-底干燥，用#00蓋玻片及 DPX 或 Pennoum 封片。

    注意事項

    必須倒掉染色液，因為氧化的染色液浮渣會留在玻片上。即使在平皿中染色，染液也不能倒掉，而必須用水從下向上置換掉。


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