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    人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)

    發(fā)布時(shí)間： 2023-01-12　　點(diǎn)擊次數(shù)： 891次

    簡(jiǎn)介

    胚胎干細(xì)胞是具有一種具有自我更新和全能分化能力的細(xì)胞，能發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調(diào)控機(jī)制理想的模型，也是用于人類疾病的干細(xì)胞治療和器官組織移植理-想的種子細(xì)胞。建立新的人類胚胎干細(xì)胞系仍然有很大的倫理學(xué)爭(zhēng)議，目前對(duì)人胚胎干細(xì)胞的研究主要就是基于已經(jīng)建立的人胚胎干細(xì)胞系的研究。

    原理

    人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理是人胚胎干細(xì)胞快速生長(zhǎng)和擴(kuò)增，而細(xì)胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。

    用途

    胚胎干細(xì)胞常用于發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調(diào)控機(jī)制理想的模型，也是用于人類疾病的干細(xì)胞治療和器官組織移植理-想的種子細(xì)胞。

    材料與儀器

    器材：
     
    ①37 ℃ 水浴鍋
     
    ②一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿
     
    ③一次性無(wú)菌移液管
     
    ④T75培養(yǎng)瓶
     
    ⑤15 mL 離心管、注射器和針頭
     
    ⑥涂有明膠的6 孔 板
     
    試劑：
     
    ①材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞
     
    ②95％乙醇

    步驟

    人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本過(guò)程可分為如下幾步：

     

    （一）試劑配制

     
    （1）膠原酶溶液的配制使用濃度1 mg ／mL 。膠原酶，30mg；DF12培養(yǎng)基，30 mL 。使膠原酶充分溶解于DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。用0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌。
     
    （2）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制DF12培養(yǎng)基，200 mL ；血清替代物50 mL ；200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液，1.25 mL ；非必需氨基酸100x溶液，2.5 mL ；b-FGF 溶液，5 mL 。
    所有組分都加入250ml培養(yǎng)瓶中，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌。培養(yǎng)基最好在2周內(nèi)使用。

     

    （3）200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液的配制200 mmol ／L -谷酰胺，5 mL ；2-巰-基-乙-醇，7 μl ，混勻。

     
    （4）b-FGF的配制b-FGF，10 μg ；0.1％BSA無(wú)菌，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分裝冷凍保存。

     

    （二）確定傳代時(shí)機(jī)

     
    通常以下情況時(shí)，胚胎干細(xì)胞需要傳代
     
    ①小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層超過(guò)2 周 。
     
    ②胚胎干細(xì)胞的克隆密度太高或克隆大小太大。
     
    ③胚胎干細(xì)胞克隆出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

     

    （三）膠原酶處理

     
    （1）需要傳代時(shí)，將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸去培養(yǎng)上清。
     
    （2）6  孔板培養(yǎng)時(shí)，每個(gè)孔加1 mL 膠原酶溶液。
     
    （3）處理至少5 min 。
     
    （4）倒置顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞克隆從培養(yǎng)板表面脫離。注意：可以看到克隆周邊會(huì)出現(xiàn)皺褶。根據(jù)消化情況，膠原酶處理時(shí)間可再延長(zhǎng)6～10 min 。

    （四）刮細(xì)胞

     
    （1）用5 mL 玻璃移液管，將細(xì)胞從培養(yǎng)板表面刮下來(lái)。
     
    （2）同時(shí)輕輕吹打膠原酶溶液，使細(xì)胞從培養(yǎng)板上面完-全脫離。
     

    （3）所有細(xì)胞團(tuán)都留在培養(yǎng)板中，直到整個(gè)6 孔 板都按步驟（1）、（2）處理完。

    注意：這些步驟可以直視下完成，也可以在解剖纖維鏡下完成。

    （五）收集并打散克隆

     

    （1）將整塊6 孔 板的細(xì)胞都轉(zhuǎn)移到一個(gè)15 mL 離心管中。
     
    （2）每個(gè)孔加1 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗，并將沖洗液也轉(zhuǎn)移到細(xì)胞懸液中。
     
    （3）在15 mL 離心管中，輕輕吹打細(xì)胞懸液數(shù)分鐘，進(jìn)一步打散細(xì)胞克隆。注意：吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。

    （六）離心傳代

     
    （1）將打散的細(xì)胞克隆，200 g 離心5 min 。
     
    （2）去除上清液。
     
    （3）輕輕拍散細(xì)胞團(tuán)，加2～3 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕混勻。
     
    （4）200 g 離心5 min 。
     
    （5）胚胎干細(xì)胞離心同時(shí)，將提前準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)板取出，吸棄MEF培養(yǎng)基。
     

    （6）用6 孔 板培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，每個(gè)孔加1 mL PBS，輕輕晃動(dòng)，洗去培養(yǎng)基中所含的血清。

    注意：PBS處理成纖維細(xì)胞的時(shí)間不要超過(guò)6～10 min 。

     
    （7）胚胎干細(xì)胞離心結(jié)束后，棄去上清液，輕輕拍散細(xì)胞團(tuán)。
     
    （8）加入2～3 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。
     
    （9）再加入足夠的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，使6 孔 板的每個(gè)孔細(xì)胞懸液體積為2.5 mL 。
     

    （10）去除飼養(yǎng)層培養(yǎng)板中的PBS，每個(gè)孔加入2.5 mL 細(xì)胞懸液，用移液管輕輕混勻。

     

    （11）在水平臺(tái)面上，短促地上下左右地晃動(dòng)培養(yǎng)板，使加入的胚胎干細(xì)胞均勻分布到飼養(yǎng)層上。

     

    （12）將培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，使克隆重新貼壁。注意：在重新貼壁的這段時(shí)間內(nèi)，要盡量少開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱，維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，以利于胚胎干細(xì)胞重新貼壁。

     

    （13）每天更換新鮮培養(yǎng)基。注意觀察克隆生長(zhǎng)狀態(tài)，在需要時(shí)按上述步驟再次傳代。

        （七）凍存

    （1）按上述步驟收集胚胎干細(xì)胞細(xì)胞懸液，200 g 離心5 min 。
     
    （2）配好的凍存液（90％胎牛血清，10％DMSO）置于冰上備用。
     
    （3）棄去上清液，將細(xì)胞團(tuán)排松散后用凍存液重懸，逐滴加入凍存液，混勻。一般一個(gè)6 孔 培養(yǎng)板凍6 支 ，重懸時(shí)每個(gè)培養(yǎng)板的細(xì)胞加6 mL 凍存液。
     
    （4）迅速將1 mL 細(xì)胞懸液裝入1.5 mL 凍存管。蓋緊后放入異丙醇凍存盒中。
     
    （5）將凍存盒降至室溫后，轉(zhuǎn)入-80 ℃ 冰箱，保存過(guò)夜。
     
    （6）次日將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐保存。
     
    注意：人胚胎干細(xì)胞凍存前不能將細(xì)胞消化成單細(xì)胞，消化后的細(xì)胞團(tuán)塊稍大為好。

     

    （八）復(fù)蘇

     
    （1）將凍存的胚胎干細(xì)胞從液氮中取出，浸入37 ℃ 水浴，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，注意凍存管蓋不要沒(méi)入水中。
     
    （2）當(dāng)只剩一個(gè)小冰晶時(shí)，將凍存管從水浴中取出。
     
    （3）將凍存管浸入95％乙醇浴消毒，在無(wú)菌超凈臺(tái)中晾干。
     
    （4）將細(xì)胞從凍存管中轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，逐滴加入4 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕混勻。
     
    （5）200 g 離心5 min ，去除凍存液。
     
    （6）去除上清液，將細(xì)胞團(tuán)輕輕拍散，加2.5 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
     
    （7）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到鋪有照射后的飼養(yǎng)層細(xì)胞的6 孔 板中。每孔加2.5 mL 細(xì)胞懸液。飼養(yǎng)層細(xì)胞提前用1 mL PBS洗一遍，去除血清。
     
    （8）放入培養(yǎng)箱，第二 天 將細(xì)胞上面漂浮的死細(xì)胞吸去并換液，按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。
     
    （9）每天觀察細(xì)胞密度。按需傳代。

    注意事項(xiàng)

    （1）所有試劑都應(yīng)記錄保質(zhì)期和批號(hào)，小包裝分裝保存，避免反復(fù)凍存。培養(yǎng)基配制后最好在2 周 內(nèi)用完。
     
    （2）胚胎干細(xì)胞克隆的消化液可有多種選擇，除了上文介紹的膠原酶消化，也可用0.05％的胰蛋白酶消化，消化時(shí)間比膠原酶消化所需時(shí)間要短，一般1～2 min ，待克隆周邊有皺褶時(shí)，要加用MEF培養(yǎng)基中止胰蛋白酶作用，其他步驟基本一致。
     
    （3）用消化傳代的時(shí)候務(wù)必不能將人胚胎干細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，否則克隆形成率很低。
     
    （4）傳代時(shí)細(xì)胞密度很重要，人胚胎干細(xì)胞一般的傳代比例是1:5～1:10。接種的細(xì)胞太少不易生長(zhǎng)，最好4～6 d 傳代一次。
     
    （5）人胚胎干細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求很高，因此必須每天換液，細(xì)胞一般培養(yǎng)在6 孔 皿中。
     
    （6）一般使用第2～4 代 的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿后一般在3 d 內(nèi)使用，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞不利于人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)。
     

    （7）人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境是37 ℃ ，飽和濕度，5％CO2。培養(yǎng)箱應(yīng)當(dāng)每月清洗和衡一次，最好不要在同一培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)其他種類的細(xì)胞，以免交叉污染。

     

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