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    單鏈 cDNA 的合成

    發(fā)布時間: 2023-04-21  點擊次數(shù): 771次

    材料與儀器

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液、溶液和試劑

    去除 RNA 酶的雙蒸水

    10XRT-PCR 緩沖液(去除 RNA 酶的雙蒸水,100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

    2. 酶和酶緩沖液

    MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(100~200U/ul)

    SUPERaseINRNA 酶抑制劑(20U/ul;Ambion)

    3. 核酸和寡核苷酸

    dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四種 dNTP)

    隨機引物(5umol/L)

    總 RNA(達(dá)到 2.5ug)

    4. 實驗器材

    薄壁的 PCR 管

    二、方法

    1. 在冰上加 2ul50umol/L 的隨機引物到薄壁的 PCR 管中(一個反應(yīng)一管)。

    2. 加入 2.5ug 的總 RNA。

    3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。

    4. 添加去除 RNA 酶的雙蒸水(RNaSe-freeH20),使體積達(dá)到 16ul。

    5.70°C 加熱 10min, 變性二級結(jié)構(gòu),然后立即放在冰上。

    6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 緩沖液。

    7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。

    8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶。

    9.42°C 溫浴 1h。

    10.95°C 加熱10min, 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

    11. 繼續(xù)擴增步驟或停止反應(yīng),-2°C 儲存。


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