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    消滅 PCR 非特異性擴(kuò)增的方法

    發(fā)布時間： 2023-06-28　　點擊次數(shù)： 1115次
    非特異性擴(kuò)增，即進(jìn)行 PCR 所擴(kuò)增出來的條帶不是所要的，引物與模板在非目的條帶處有錯配，導(dǎo)致延伸產(chǎn)物不是目的條帶。例如引物二聚體，即引物在退火過程中產(chǎn)生了 hairpin 結(jié)構(gòu)或其他二級結(jié)構(gòu)，或者引物在模板的某些位置非特異性地結(jié)合，也同樣會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物都是通過引物延伸產(chǎn)生的。當(dāng)引物產(chǎn)生了二聚體或者非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物之后，引物本身就無法再延伸形成 PCR 產(chǎn)物了，這樣的情況下，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物越是多，那目的產(chǎn)物就越是少。如果在 qPCR 過程中，就會在熔解曲線中形成雙峰。

    消滅 PCR 非特異性擴(kuò)增的方法：
    １、引物設(shè)計的過程中要用 Primer premier 5.0 來驗證一下二聚體；
     
    2、 引物合成后，先做一次梯度 PCR，檢測最合適的退火溫度，一般高退火溫度可以提高引 物對模板的特異性從而降低引物二聚體；
     
    3、 降低 Mg2+濃度，鎂離子濃度高，會導(dǎo)致大量的非特異性擴(kuò)增，但是沒有鎂離子的話，也會導(dǎo)致 Taq 酶的失活；
     
    4、降低 dNTP 濃度，dNTP 也是非特異性擴(kuò)增的一個罪魁禍?zhǔn)祝档退臐舛?，也能有效降低二聚體及其他非特異性擴(kuò)增；
     
    5、降低引物濃度，一般的 PCR 引物都是過量的，降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級結(jié)構(gòu)的可能性；
     
    6、提高退火溫度，這個道理很簡單，引物的退火溫度提高，引物間的二級結(jié)構(gòu)形成可能性就會降低；
     
    7、延長退火時間，這個也可以減弱引物間結(jié)合的可能性；
     
    8、DMSO 及甜菜堿，這些 PCR 促進(jìn)劑，主要是用于 CG 含量高的模板上，降低 DNA 的二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，但根據(jù)經(jīng)驗，加入 DMSO 之后需要同時提高一點退火溫度來補平（qPCR 不太適用）；
     
    9、熱啟動法，通過 95℃的高溫?zé)釂?，高溫解鏈，使得引物間的二級結(jié)構(gòu)破壞，以此降低二聚體產(chǎn)生。


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